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Analyse von DNA - Sequenzierung von DNA:

Sequenzierung von DNA:

In einem vorherigen Kapitel haben wir uns mit dem genetischen Code bzw. dem menschlichen Genom befasst. Dabei stellt sich die Frage, wie die Basensequenzen der DNA bestimmt werden können. Dies geschieht immer nach dem gleichen Muster. Die zu untersuchende DNA bzw. DNA-Fragmente werden isoliert, gezielt vervielfältigt und dann die Basensequenz entschlüsselt (sogenannte DNA-Sequenzierung). Im Rahmen einer DNA-Analyse finden daher immer zwei Teilschritte statt: Die Vervielfältigung eines DNA-Fragmentes und die Sequenzierung der (vervielfältigten) DNA-Sequenz.

Vervielfältigung von DNA (Polymerasekettenreaktion)

Eines der bedeutendsten Verfahren zur Vervielfältigung von DNA ist die sogenannte Polymerasekettenreaktion (kurz: PCR). Dieses Verfahren geht auf Kary Mellius Ende des 20 Jhd. zurück. Der Vorteil der PCR ist, dass sich innerhalb kurzer Zeit selbst geringe DNA-Mengen vervielfältigen lassen. Ein Zyklus innerhalb der PCR unterteilt sich in Denaturierung, Hybridisierung und Elongation

  • Denaturierung: Bei Temperaturen von 90 - 95°C wird ein doppelsträngiges DNA-Fragment erhitzt. Durch diese Wärmemenge wird die DNA "denaturiert", das bedeutet, die Bindungen (die Wasserstoffbrückenbindungen) zwischen den komplementären Basen lösen sich auf. Dadurch kann die DNA in Einzelstränge aufgetrennt werden, man sagt dabei, dass die DNA einzelsträngig gemacht wird. 
  • Hybridisierung: Der wichtigste Prozess bei der PCR ist die "Markierung" des DNA-Bereiches, der vervielfältigt werden soll. Dazu dienen sogenannte Primer. Um die PCR zu starten, wird ein gegenläufiges Primerpaar eingesetzt. Dieser Schritt wird bei Temperaturen von 50 - 60°C durchgeführt. Dabei lagern sich die Primer an die DNA an (der Primer lagert sich an die 3' Enden des DNA-Einzelstränge). 
  • Elongation: Von dem  3' Ende ausgehend "synthetisiert" ein Enzym, die DNA-Polymerase, den komplementären DNA-Strang (bei Temperaturen von ca. 70°C). Bei der Bildung des DNA-Doppelstrang gilt das Prinzip der Komplementarität, d.h. es lagern sich nur komplementäre Basen an (d.h. A/T [Adenin + Thymin] bzw C/G [Cytosin + Guanin]). Für die "Synthese" der DNA wird oft die sogenannte Taq-Polymerase eingesetzt. Nachdem die Synthese des DNA-Doppelstranges erfolgt ist, sind aus zwei DNA-Einzelsträngen (die aus einem DNA-Doppelstrang entstanden sind) zwei gleiche DNA-Doppelstränge entstanden.
Nach der Elongation beginnt der programmierbare Cycler einen neuen Zyklus, wobei die Temperaturen wieder auf 90 - 95°C erhöht wird, so dass die Phase der Denaturierung beginnt und sich alle Doppelstränge erneut auftrennen. Insgesamt sind bei einer Polymerasekettenreaktion zwischen 30 und 50 Zyklen möglich,  so dass eine exponentielle Vervielfältigung von kleinen DNA-Mengen möglich ist.



Sequenzierung von DNA

Nachdem nun nach der Vervielfältigung der DNA mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion erfolgt ist, kann die Basenabfolge der DNA auf aufgeklärt werden. Inzwischen gibt es viele Methoden, die DNA zu sequenzieren. Die im Biologieunterricht besprochene Sequenzierung ist die Methode nach Sanger und Coulsen.

Die Sequenzierung nach Sanger und Coulsen wird aufgrund des Reaktionsmechanismus auch als Kettenabbruch- oder Didesoxysequenzierung bezeichnet. Die Sequenzierung der Basen basiert auf der Detektion von markierten ketten-abbrechenden Nukleotiden den sogenannten ddNTS, die während der Polymerisierung durch eine DNA-Polymerase eingebaut werden. 

Wie im ersten Schritt der Polymerasekettenreaktion wird auch bei der Sequenzierung im ersten Schritt die das doppelsträngige DNA-Fragment durch Erhitzen denaturiert, wodurch diese Doppelstränge in Einzelstränge aufgetrennt werden

Im zweiten Schritt werden neben der DNA-Polymerase und dem Primer sowohl Desoxynukleotide dNTP ("die normalen vier Nukleotidbasen") als auch Didesoxynukleotide ddNTP (die ddNTPs besitzen im Gegensatz zu den dNTP keine Hydroxylgruppe an 3'-Position) den vervielfältigten Einzelsträngen zugegeben. Bei der anschließenden Synthese des (komplementären) DNA-Stranges werden beide Basenarten dNTP und ddNTP eingebaut. Wird in den komplementären Strang ein dNTP (eine normale Base A, C, T, G) eingebaut, verläuft die Synthese des komplementären DNA-Stranges weiter. Wird ein ddNTP in den Strang eingebaut, stoppt die Synthese des komplementären DNA-Stranges. Da die Hydroxylgruppe (an 3'-Position) beim ddNTP fehlt, kann keine weitere Phosphatgruppe einer Nukleotidbase "angebunden" werden. Dadurch bricht die DNA-Synthese bei den neu gebildeten DNA-Strängen ab und es entstehen DNA-Stränge mit unterschiedlicher Länge.

Durch den bisherigen Prozess entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die aber stets mit einem ddNTP enden. Anschließend werden die DNA-Fragmente  mit Hilfe einer Elektrophorese aufgetrennt. Dabei wandern kleinere Stränge im elektrischen Feld (Gleichspannung) schneller, als die größeren Stränge. Bei modernen Gräten bewegen sich die DNA-Fragment entsprechend ihrer Größe unterschiedlich schnell bis zu einem Detektor bzw. Laser. Dabei macht man sich zunutze, dass die ddNTP mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoff marktiert worden sind. Durch den Laser wird nun der Fluoreszenzfarbstoff angeregt, wobei ein Detektor das entsprechende elektromagnetische Spektrum aufzeichnet. Da die DNA-Fragmente der Größe nach detektiert werden (von klein zu groß) kann hiermit die Reihenfolge der Nukleotide in der ursprünglichen doppelsträngigen DNA ermittelt werden. Diese Reihenfolge ergibt somit die DNA-Sequenz, also die Basenabfolge in der DNA (= genetische Code).

Hinweis:

Inzwischen sind die meisten DNA-Polymerasen (beispielsweise die Taq-Polymerase) temperaturbeständig, so dass die DNA-Sequenzierung nach Sanger und Coulson wie eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt werden kann (Denaturieren, Markieren und Verlängern). Im Vergleich zur PCR darf aber nur ein Primer (einer der beiden der PCR) verwendet werden, damit nur ein DNA-Einzelstrang vervielfältigt wird und nicht beide. 

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